Cell | 人类胚胎时期内胚层器官及肠道类器官单细胞转录组图谱

在胚胎发育期间，原始肠道会逐渐分化成前肠、中肠和后肠。前肠发育成为肺部、食道、胃部、肝脏等器官，而中肠及后肠则分别发育成为小肠与大肠。以前的报道以小鼠为模型，揭示了转录因子、信号因子在原始肠道各部位的差异表达是器官分化发育的重要分子基础。但各器官由不同细胞类型组成，且人类与小鼠存在差异。在细胞类型水平上，人类组织器官特异性的调控机制仍有待阐明。对人类胚胎阶段的器官进行转录组测序无疑能有效解答这个问题。可是科研中使用的人类胎儿组织来自流产胎儿，数量有限。为了解决这个问题，科学家研究建立了体外诱导培养类器官的方法。通过在培养液中加入特定的信号因子，模拟体内发育的环境，促使胚胎干细胞或者诱导多功能干细胞发育形成特定类似于器官的体外培养组织，即类器官。已有的研究表明这些类器官总体上能重现对应器官的特征。然而在细胞类型层面，是否产生了脱靶细胞类型，或缺失某些体内器官中存在的细胞类型，以及类器官与体内器官中对应细胞类型的相似程度如何，这些问题仍需要系统的量化研究。

针对上述问题，2021年5月20日，巴塞尔分子与临床眼科研究所Gray Camp研究组、苏黎世联邦理工学院Barbara Treutlein 研究组以及密西根大学Jason Spence 研究组合作（余谦慧、Umut Kilik、Emily Holloway为该文章共同第一作者）在Cell杂志发表了题为Charting human development using a multi-endodermal organ atlas and organoid models 的研究文章。

为了构建较为全面的人体内胚层器官转录组图谱，该文章研究者收集了7至21周流产胎儿的食道、肺部、胃部、小肠、结肠等5个不同器官共11个不同部位的组织，使用10x Genomics进行单细胞转录组测序。通过聚类分析，该数据集可划分为上皮细胞、间质细胞、内皮细胞、免疫细胞、神经细胞、红细胞、肝细胞等七个大类及下属27个小类。通过比较，发现上皮细胞、间质细胞的器官特异性较大，而内皮细胞、免疫细胞、神经细胞的较小。各内胚层器官的功能主要由上皮细胞执行，所以上皮细胞转录组器官特异性高是预期的结果。让人觉得意外的是，间质细胞以前常常被认为是支持性细胞，类似于建筑物的砖瓦。此次研究中发现的不同器官间质细胞的差异，尤其是肺部与其他器官的差异，是一个新的发现。

该研究还利用RNA荧光原位杂交技术RNAscope对单细胞数据得到的肺部与小肠间质细胞差异表达基因进行验证。各器官内的上皮细胞还可以划分为不同的细胞类型，执行不同的功能。这些功能形态各异的上皮细胞可以由上皮干细胞分化发育而成。因此，该研究还对不同器官的上皮干细胞在转录组间的差异利用转录组去卷积进行细致研究，并鉴定出差异表达的转录因子。同时，文章作者还根据配体、受体的表达模式研究了上皮-间质细胞类型间的交流不同器官间的差异。上述分析均在细胞类型水平上提供了器官组织特异性调控机制的候选因子。作者还为文中的数据建立交互式网站 (http://guttuber.iob.ch/app/)，读者可自由访问探索。

以文中所建立的转录组图谱为参考系，该文章以肠道类器官为例，对人类多功能干细胞定向分化所形成的类器官对体内器官的还原程度进行了系统的量化研究。文章所研究的肠道类器官起始于胚胎干细胞细胞系，通过特定的培养条件，依次定向分化形成内胚层细胞与肠道细胞。经过体外培养四周后，类器官被移植到免疫缺陷小鼠肾脏内进一步成熟分化。通过对移植后肠道类器官进行单细胞转录组测量，研究者不仅发现了各常见肠道上皮细胞类型，同时发现了CDX2低表达的上皮细胞。CDX2是肠道上皮细胞的分子标记物，这暗示该方法产生的肠道类器官存在非肠道细胞类型。根据胚胎转录图谱各器官组织的差异表达基因的表达模式，确实发现这些CDX2低表达细胞类型与肺部、胃部等非肠道器官更类似。脱靶细胞类型大概占移植后类器官细胞总数20-30%。胚胎干细胞具有全能性，有少部分细胞在定向分化过程中形成脱靶细胞类型是可以理解的。总体而言，由此产生的肠道类器官在分子与形态特征与体内肠道非常相像，是很好的模型。文章通过将移植后肠道类器官的上皮细胞与胎儿、成人小肠的上皮细胞进行比较，进一步发现移植后肠道类器官与胎儿阶段的非常类似，而与成人肠道不一样。

文章接着对体外培养阶段的肠道类器官进行研究，从而揭示肠道发育早期的细胞状态。转录组比较显示，体外培养阶段的肠道类器官中的肠道上皮细胞可能是早期的肠道上皮干细胞。因此作者将其与移植后肠道类器官、胚胎及成人小肠的上皮干细胞结合，从而构建肠道上皮干细胞从早期到成熟阶段细胞状态转换的全面分析（原文图5）。

在上皮干细胞成熟过程中，各信号通路基因的表达模式发生差异。而且伴随不同阶段肠道上皮干细胞的产生，肠道间质细胞的细胞类型也相应发生改变。其中，LGR5+上皮干细胞与上皮下间质细胞都基本在产生胚胎发育8周产生。这些结果显示间质细胞与上皮干细胞间的交流，尤其是上皮下间质细胞对于上皮干细胞的发育非常重要。随后，作者通过在肠道类器官的培养液中加入上皮下间质细胞特异性表达的配体NRG1并进行单细胞转录组测序，证明了NRG1能促进肠道上皮干细胞的成熟。

另外，通过调节子的生物信息学构建，对CRISPR/Cas-9介导的CDX2敲除细胞系产生的肠道类器官进行单细胞转录组学分析，并结合与胚胎内胚层器官图谱的比较，该文章研究者发现转录因子CDX2通过转录因子网络及细胞间交流，不仅对肠道上皮细胞，对间质细胞的肠道特征的建立都具有不可或缺的作用。

总的来说，该文章提供了高质量的人类胚胎时期肠道等内胚层器官的转录组图谱，筛选了器官发育过程中重要的调控因子，为胚胎组织与类器官的结合分析提供了很好的范例。

原文链接：

https://doi.org/10.1016/j.cell.2021.04.028